聚合酶鏈式反應(PCR)原理與操作步驟
日期:2022-08-10 | 中海生物技術文庫 | 瀏覽:1351 次
⑴聚合酶鏈式反應
多聚酶鏈式反應簡稱PCR(Polymerase Chain Reaction)。PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。PCR又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。
⑵PCR原理
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴增技術,是以單鏈DNA為模板,4種dNTP為底物,在模板3,末端有引物存在的情況下,用酶進行互補鏈的延伸,多次反復的循環能使微量的模板DNA得到極大程度的擴增,從而在短時間內使DNA片段在數量上呈指數增加。
⑶聚合酶鏈式反應(PCR)操作步驟
PCR由變性→退火→延伸三個基本反應步驟構成:
①模板DNA的變性
模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備。
②模板DNA與引物的退火(復性)
模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
③引物的延伸
DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈,重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
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