制藥用水系統(tǒng)是制藥行業(yè)所需的潔凈公用工程系統(tǒng)。制藥用水可以作為清潔劑，用于淋洗和清潔儲(chǔ)罐、設(shè)備等，或作為原輔料，用于藥品調(diào)配、合成與制劑生產(chǎn)，也可作為高壓滅菌器的蒸汽供應(yīng)等。制藥用水的化學(xué)純度和微生物負(fù)荷會(huì)直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量，每家制藥企業(yè)都會(huì)投入大量的資源建設(shè)和維護(hù)制藥用水系統(tǒng)。

根據(jù)生產(chǎn)工藝和應(yīng)用場(chǎng)景的不同，藥品生產(chǎn)工藝中使用的水，主要分為飲用水、純化水、注射用水和滅菌注射用水。雖然每一級(jí)水都有嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，但是每一級(jí)水也都是微生物污染的潛在來源，因此，制藥用水系統(tǒng)微生物負(fù)荷的控制尤為關(guān)鍵。在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，為了更好地控制制藥用水系統(tǒng)中的微生物水平，除了通過生物負(fù)載測(cè)定微生物數(shù)量外，微生物學(xué)家還需要了解水系統(tǒng)中存在的微生物類型，不僅有助于明確水系統(tǒng)中微生物污染趨勢(shì)的變化，也便于預(yù)測(cè)它們是否會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的問題，比如水系統(tǒng)中是否有形成生物被膜的風(fēng)險(xiǎn)，或者它們是否對(duì)產(chǎn)品(從而對(duì)患者)造成特殊風(fēng)險(xiǎn)。

本文對(duì)制藥用水系統(tǒng)中主要的微生物類型及其風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行綜述，以期為制藥企業(yè)水系統(tǒng)的微生物控制提供幫助。

1、純化水微生物群落結(jié)構(gòu)

純化水為飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制備的制藥用水，不含任何附加劑。純化水可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗(yàn)用水，也可作為中藥注射劑、滴眼劑等滅菌制劑所用飲片的提取溶劑等。有人員從6300 個(gè)純水樣本篩選到315個(gè)超警戒線的樣本，并回收了 347 個(gè)分離株。純化水微生物中主要的屬為 Ralstonia（羅爾斯通菌屬）和 Burkholderia（伯克霍爾德菌屬）， 而 Ralstonia pickettii （皮氏羅爾斯通氏菌）和Burkholderia cepacia （洋蔥伯克霍爾德氏菌）為純化水中最主要的菌種。

2、注射用水微生物群落結(jié)構(gòu)

注射用水為純化水經(jīng)蒸餾所得的水，需符合細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)要求。制藥企業(yè)應(yīng)定期清洗與消毒注射用水系統(tǒng)。注射用水的儲(chǔ)存方式和靜態(tài)存儲(chǔ)期限應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證確保水質(zhì)符合質(zhì)量要求。注射用水可作為配制注射劑、滴眼劑等溶劑或稀釋劑及容器的精洗。由于注射用水嚴(yán)格的質(zhì)量控制，通常從注射用水系統(tǒng)中分離的微生物很少。如果水系統(tǒng)的管道設(shè)計(jì)可有效避免所謂的“死角”(水流中斷的區(qū)域)并且水流保持連續(xù)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，則污染風(fēng)險(xiǎn)會(huì)進(jìn)一步降低。有人員在15年間收集了46800 個(gè)注射用水樣本。研究發(fā)現(xiàn)，很少有注射用水樣品不滿足水系統(tǒng)的質(zhì)量要求。46800 個(gè)樣本中只有300 個(gè)樣本檢測(cè)到革蘭氏陰性桿菌(比率為 0.6%)，最終回收了439 個(gè)革蘭氏陰性桿菌(每個(gè)樣本少于2種不同的生物體)。數(shù)量上最常見的微生物種名還是Ralstonia pickettii （皮氏羅爾斯通氏菌）和Burkholderia cepacia （洋蔥伯克霍爾德氏菌）。

3、制藥用水中主要的微生物及其危害性分析

洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合體 (Burkholderiacepacia complex，BCC)和皮氏羅爾斯通菌是制藥用水中主要的污染菌。

3.1 BCC

BCC因引起洋蔥患病而得名，實(shí)際上它可以感染植物界及人類，具有較強(qiáng)跨界感染能力，可以使患有囊性纖維化和慢性肉芽腫性疾病的患者引起嚴(yán)重的“洋蔥伯克氏菌綜合癥”致死。免疫功能低下患者(虛弱的老年人、HIV 陽性者、接受化療的癌癥患者等)中也有該菌感染的報(bào)道[8]。2007 年發(fā)表的一份調(diào)查報(bào)告顯示，在 1998 年~2006 年FDA 非無菌藥品微生物污染召回事件中，占 22%的污染微生物為洋蔥伯克霍爾德菌，污染藥品類型包括：痤瘡膏、糖漿、吸入液、非酒精身體噴霧劑、嬰兒油、洗發(fā)水和漱口水。2004 年~2011年，有 34%的產(chǎn)品召回與該菌的污染有關(guān)。2012年~2019 年的 FDA 召回事件表明，洋蔥伯克霍爾德菌是非無菌藥物微生物污染召回的頭號(hào)原因(占45.3%，共發(fā)生 102 次召回)。這些召回事件引起了美國(guó)藥典委員會(huì)的重視，并特別發(fā)布 USP<60>非無菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查：伯克霍爾德菌復(fù)合物，以檢測(cè)非無菌產(chǎn)品中是否存在 BCC 物種。

BCC 之所以是制藥行業(yè)主要的不可接受微生物，主要原因是由于它具備以下能力：①能在寡營(yíng)養(yǎng)和低滲透壓的純水環(huán)境生存的能力。保持完整外膜結(jié)構(gòu)的能力與該菌在水環(huán)境中長(zhǎng)期存活有關(guān)。在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，形態(tài)從典型的革蘭氏陰性桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)榍蚓⒖蛇M(jìn)入休眠狀態(tài)活著但不可培養(yǎng)。該階段細(xì)胞代謝活性降低，膜脂成分改變，導(dǎo)致外膜通透性降低，從而增加對(duì)多黏菌素B的耐受性。此外，大多數(shù)基因表達(dá)水平降低，而氨基酸、脂肪酸和磷脂代謝基因表達(dá)水平增加，這表明這些化合物可以在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下替代碳源和能源。②BCC具備可以在多種藥物中生長(zhǎng)和增殖能力。BCC 細(xì)菌能夠使用多種有機(jī)化合物作為碳源和能源，其中一些是很難分解代謝的外源性物質(zhì)[14]。例如，它們能夠通過對(duì)芳香結(jié)構(gòu)氧化并對(duì)鹵化化合物進(jìn)行分解，從而在硝基芳香族和芳香族化合物中生存，可導(dǎo)致藥品活性成分的降解，從而影響藥物的穩(wěn)定性和純度，以及它們的效力和有效性[15]。藥物降解還可能導(dǎo)致有毒物質(zhì)的形成[16]。最終對(duì)這類產(chǎn)品的消費(fèi)者構(gòu)成了嚴(yán)重的風(fēng)險(xiǎn)。③對(duì)細(xì)菌抑制劑、抗生素有強(qiáng)大的耐受機(jī)制的能力。它們可以通過形成生物被膜、耐藥基因等方式抗逆。

3.2皮氏羅爾斯通菌

通過分析 2012 年~2019 年的 FDA 召回報(bào)告發(fā)現(xiàn)，羅氏菌(占總召回?cái)?shù)的 20%，共發(fā)生 45 次召回)排在洋蔥伯克霍爾德菌之后，是非無菌藥物微生物污染召回的第二大原因。

皮氏羅爾斯頓菌不被認(rèn)為是主要病原體，它的毒力也較低，但它引起的感染報(bào)導(dǎo)屢見不鮮，包括血流感染、腦膜炎和瘧原蟲體外培養(yǎng)污染等。許多皮氏羅爾斯頓菌感染病例是由于受污染的溶液引起的，包括注射用水、用純化水制成的鹽水溶液和無菌藥物溶液。這些藥物可以靜脈注射和作為滴注液，用于清潔傷口或用于氣管內(nèi)吸痰，從而導(dǎo)致血液(菌血癥)和呼吸道感染。而這些溶液產(chǎn)品的污染最大可能是發(fā)生在制造階段。過濾器往往用于一些藥物的終端滅菌，但皮氏羅爾斯頓菌能夠通過 0.45µm 和 0.22µm 的濾膜，從而使得終產(chǎn)品染菌。在1983 年，5名嬰兒因?yàn)槭褂昧耸芷な狭_爾斯頓菌污染的呼吸治療溶液而被感染，而這正是由于蒸餾水的生產(chǎn)過程中繞過了一個(gè) 82 ℃的儲(chǔ)槽，使得該菌活著進(jìn)入了溶液。此外，該菌也能在醫(yī)院消毒劑中存活，包括洗必泰和乳酸依沙吖啶。

盡管皮氏羅爾斯通菌毒力很低，但正如上文所提及的該菌已被確定為會(huì)導(dǎo)致許多潛在的有害感染和死亡。因此，制藥用水中尤其要控制此菌的污染。

4、制藥用水系統(tǒng)的微生物控制措施

即使藥企對(duì)制藥用水系統(tǒng)進(jìn)行嚴(yán)格的控制，還是有很小數(shù)量微生物存在于各個(gè)級(jí)別的用水系統(tǒng)中。此外，制藥企業(yè)對(duì)于水系統(tǒng)的微生物檢測(cè)也有不足之處，主要有：①水中的微生物分布遵循泊松分布而非均勻分布，這使得水體微生物的回收率往往重復(fù)性不佳；②培養(yǎng)條件的限制。培養(yǎng)基的選擇性和培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的受限，都會(huì)影響水體中微生物的回 收率。如受 培養(yǎng)基的選擇性，Prosthecate bacteria( 柄桿菌 ) ，Mycobacteriumspecies( 分枝桿菌 ) ， Spirochaetes( 螺旋體 ) ，Thiobacillus species(硫桿菌屬)等種類很難被培養(yǎng)；③采樣方式的局限性。目前的采樣大多針對(duì)自由漂浮狀態(tài)的微生物，而不是對(duì)附著在底層的微生物或生物膜群落的部分進(jìn)行檢測(cè)；④制藥用水是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)及其缺乏的極端環(huán)境，絕大多數(shù)的微生物以“活著但不可被培養(yǎng)”或者生物被膜的狀態(tài)存在，因此目前藥企的培養(yǎng)結(jié)果也僅占水系統(tǒng)微生物的小部分。

正是由于微生物在制藥用水系統(tǒng)中的不確定性，制藥企業(yè)的微生物專家需要考慮和了解水系統(tǒng)中的微生物的不斷變化的模式，開展一系列的工作，包括：①建立各級(jí)水系統(tǒng)的微生物數(shù)據(jù)庫。對(duì)構(gòu)成不同水系統(tǒng)微生物常見分離株進(jìn)行鑒定，并了解不同水質(zhì)之間是否存在關(guān)系。②建立趨勢(shì)分析的方法。可以連續(xù)幾年對(duì)水系統(tǒng)中的微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和趨勢(shì)分析，檢查微生物的種類是否與預(yù)期在水系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的微生物相似，同時(shí)能夠?qū)厔?shì)的任何變化作出及時(shí)的響應(yīng)。③收集并建立水系統(tǒng)常見的微生物菌種庫，用于培養(yǎng)基驗(yàn)證、消殺驗(yàn)證等。

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