雞傳染性支氣管炎病毒（M41株）血凝抑制試驗抗原、陽性血清與陰性血清使用說明書

日期：2023-12-05　|　中海生物技術文庫　|　瀏覽：1185 次

本抗原系用雞傳染性支氣管炎病毒（M41株）接種SPF雞胚，收獲尿囊液，經A型魏氏梭菌菌液活化制成。血凝效價不低于1:128，用于檢測雞傳染性支氣管炎的抗體；陽性血清系用M41株病毒接種SPF雞制備的免疫血清；陰性血清為SPF雞血清。

【用法與判定】

1 IB HA工作抗原的制備

1.1 IB HA 抗原效價測定

1.1.1 用移液器在96孔微量板上從第1孔至第12孔，依次加入30μl稀釋液。

1.1.2 取30μl IB HA抗原加入第1孔，依次作2倍系列稀釋至第11孔后棄去30μl稀釋液，各孔均應混合均勻。

1.1.3 每孔加入1%雞紅細胞懸液30μl，再補加30μl稀釋液（保證與HI試驗同反應體積），同時設立紅細胞懸液對照孔。

1.1.4 將96孔板至振蕩器上振蕩10s，置2~8℃作用45min～60min分鐘，判定結果。判定時，將微量板傾斜45°，30s內觀察結果，對照孔紅細胞應完全沉淀到孔底并呈淚珠樣流滴（不凝集—），HA陽性孔紅細胞應均勻分布于孔內（完全凝集#）或少量沉淀但不呈淚珠樣流滴（不完全凝集++），使紅細胞完全凝集的最大稀釋倍數判為該抗原的HA效價。

上表所示血凝抗原的血凝價為1:128。

1.2. 抗原工作液配制及檢驗

1.2.1 4個HA單位（4HAU）的工作抗原的配制：如果IB HA抗原的HA效價測定結果為1:128，則4個HA單位為128/4=32，將HA抗原用稀釋液稀釋32倍，即為4HA單位的工作抗原液。

1.2.2 回歸試驗：在96孔V型板中選取6列4行，每列均加入30μl PBS，第2列加入60μl PBS，第6列加入120ul PBS。在第1列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（2倍稀釋），用移液器（排槍）反復吹打10次后，吸取30μl加入第3列（4倍稀釋），反復吹打10次后吸取30μl加入第5列（8倍稀釋），反復吹打10次后，棄去30μl。

在第2列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（3倍稀釋），用移液器反復吹打10次后，棄去30μl，再吸取30μl加入第4列（6倍稀釋），反復吹打10次后，棄去30μl。在第6列前3行中加入稀釋好的4HAU 30μl（5倍稀釋），用移液器反復吹打10次后，棄去120μl，每孔加入30μl PBS，再加入30μl 1％紅細胞懸液，室溫靜置30min～45min，對照孔的紅細胞全部沉淀時，觀察判讀結果。

1.2.3 4單位抗原配制：根據回歸試驗結果，配制4HAU。例如回歸試驗結果為1:5，則將抗原稀釋40倍（假設抗原血凝效價為1:128，初步4單位抗原為1:32，根據回歸結果，抗原應稀釋倍數為32×5÷4即可，也應采用兩步稀釋法）。

2 血凝抑制試驗（HI）

2.1 血凝板每排檢測1份被檢血清，設陽性血清與陰性血清對照。

2.2 第1孔～第10孔，每孔加入30μl PBS，第11孔加入30μl（抗原對照孔），第12孔加入60μl（紅細胞對照孔）。

2.3 取待檢血清30μl加入第1孔中（懸空加入，槍頭棄去，更換新槍頭進行稀釋），用移液器對待檢血清作倍比稀釋至第10孔：即將第1孔用移液器反復吹吸10次后，吸出30μl移至第2孔，再反復吹吸10次后，吸出30μl移至第3孔，依此類推至第5孔更換一次槍頭，繼續稀釋至第10孔，從第10孔中吸出30μl棄去，如表3。